全球超过13亿人患有后天性听力下降，感音神经性聋（sensorineuralhearingloss，SNHL）最多见，致聋原因主要包括噪音、耳*性药物、衰老、遗传、感染等因素，目前尚无可治疗的药物（突发性耳聋除外）。氨基糖甙类抗生素（aminoglycosides，AGs）所致耳*性聋是获得性SNHL的主要类型之一。
对于需要多疗程静脉用药的患者（例如，结核病和囊性纤维化病患者），AGs耳*性的致病率甚至超过50%，但临床上缺乏有效的防治对策。Htra2基因编码的线粒体丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2，可与X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）结合发挥促进细胞凋亡的作用。李华伟/舒易来团队在前期研究中发现Htra2基因在新霉素损伤后的耳蜗中表达水平明显上升，可能参与了耳*性聋的发病。CRISPR/Cas9基因编辑已在遗传性聋基因治疗研究领域取得了一定进展，但尚无用于防治获得性非遗传性SNHL的研究。
年3月22日，复旦大医院李华伟教授与舒易来研究员团队在GenomeBiology期刊上发表了题为：PreventionofacquiredsensorineuralhearinglossinmicebyinvivoHtra2geneediting的研究论文。
该研究设计了两种针对Htra2基因的CRISPR/Cas9系统（SpCas9和SaCas9系统），通过新型腺相关病*（AAV）Anc80L65运载进入小鼠内耳，实现在体Htra2基因有效编辑，促进耳蜗毛细胞存活，显著改善氨基糖甙类抗生素暴露后小鼠的听觉功能。
据悉，这是国际上首个基于CRISPR/Cas9基因编辑用于防治获得性非遗传性感音神经性聋成功的研究。
该研究首先构建针对Htra2基因的SpCas9系统，设计了三个特异性的向导RNA（guideRNAs，gRNAs），在体外HEI-OC1细胞系检测三个gRNAs的切割活性，发现Sp-g1、Sp-g2和Sp-g3的体外编辑效率分别为87.27±0.02%、71.72±1.27%和74.88±0.77%。之后在体外培养的耳蜗Corti氏器中验证Anc80L65–SpCas9体系对耳蜗毛细胞的保护作用。
AAV-Anc80L65可高效转导耳蜗内、外毛细胞，但AAV包装容量有限，很难通过单载体包装整个SpCas9系统。该研究采用split-SpCas9策略，将SpCas9分割，并用双AAV包装；通过多位点切割提高敲除效率。在体外Corti氏器新霉素损伤模型中，所构建的Anc80L65–SpCas9–Htra2-gRNA治疗体系可敲除Htra2基因，促进耳蜗毛细胞存活，有效预防了氨基糖甙类抗生素的耳*性。
在体外新霉素损伤模型中证实了该基因编辑系统的有效性后，进一步于体内探索该系统的疗效。由于Anc80L65–SpCas9系统需要分割成双AAV，这可能会影响整个Cas9系统在毛细胞的转导效率。因此，该研究也构建了Anc80L65–SaCas9单AAV载体系统，检测其对新霉素耳*性聋的预防作用。
研究发现，在体内新霉素损伤模型中，无论是SpCas9还是SaCas9系统，均能有效预防氨基糖甙类抗生素所致耳*性聋。经过AAV–SpCas9体系预处理的小鼠在新霉素损伤后2周表现出更多的毛细胞存活，尤其在耳蜗中、底圈区域。该基因治疗体系对小鼠听觉功能也有明显保护作用。听力改善最明显的小鼠在8kHz的ABR阈值比对侧耳下降40dB。实验观察到新霉素损伤后8周，AAV–SpCas9体系的听力保护作用仍然长期持续。
AAV–SaCas9体系同样可以促进耳蜗中、底圈毛细胞的存活并改善听力。4周龄小鼠注射耳的ABR阈值在测试的所有频率（4、8、16、24和32kHz）均比未注射耳显著下降，平均保护阈值10–20dB。在小鼠6周龄，保护效果仍十分明显，最好的阈值改善达到50dB。课题组同时进行了AAV–CRISPR/SpCas9及SaCas9体系的安全性评估，在研究观察期内，未发现明显的脱靶情况，且对野生型小鼠的听力没有影响，说明该治疗体系是安全的。
该研究证明了Htra2基因是潜在的预防氨基糖甙类抗生素耳*性的治疗靶点；还证明了以基因编辑体系对Htra2编辑可安全、有效预防氨基糖甙类抗生素所致耳*性聋，为获得性聋的干预临床转化提供了科学依据。
复旦大医院李华伟教授和舒易来研究员为共同通讯作者，顾晰博士后、王大奇博士后和徐值娇助理实验师为共同第一作者。该研究的第一单位和通讯单位均为复旦大医院。
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