耳蜗毛细胞是声音的感受器，转录因子Atoh1突变小鼠完全丧失毛细胞，相反，过表达Atoh1能够额外产生更多的毛细胞。Atoh1的重要生物学功能使之成为毛细胞发育再生领域的一个重要靶点。因此，探索Atoh1表达的调控机制具有重要的科学意义。
Atoh1在毛细胞发育过程中高度动态变化，但其精准调控机制知之甚少。过去20年，Atoh1增强子1（Eh1）被认为对Atoh1的表达至关重要。然而，这一假说一直未得到体内实验的证实，且毛细胞中是否存在尚未发现的其他Atoh1增强子也未知。
年8月4日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）刘志勇研究组与中科院遗传与发育生物学研究所陆发隆研究组合作，在《美国国家科学院院刊》（PNAS）在线发表了题为：ThreedistinctAtoh1enhancerscooperateforsoundreceptorhaircelldevelopment的研究论文。
该研究解析了新生小鼠耳蜗毛细胞的全基因组开放染色质图谱，发现和验证了两个之前未知的Atoh1增强子。研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除单个或同时敲除多个Atoh1增强子，揭示了Atoh1的三个增强子以剂量依赖性协同调控毛细胞发育。
该研究为Atoh1表达的精准表观遗传学调控机制提供了更深入的理论依据，并为耳蜗毛细胞再生提供了新的潜在靶点。
该研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除Eh1、Eh1-/-小鼠耳蜗毛细胞发育完全正常，这表明Eh1对于毛细胞的发育不是必需的。该结果和预期完全相反，提示毛细胞存在尚未发现的其他Atoh1增强子。
研究流式分选获得新生小鼠耳蜗毛细胞（图1A），并利用染色质开放性测序技术（ATAC-seq），建立了毛细胞的全基因组染色质开放图谱，发现了两个位于Atoh1远端的新增强子（Eh2和Eh3）。Eh2和Eh3只在毛细胞中开放，而在对照组（小脑颗粒细胞前体细胞，同样表达Atoh1）中处于关闭状态，提示Eh2和Eh3是毛细胞特异的调控元件（图1B）。
科研团队构建了转基因小鼠，验证了Eh2和Eh3是特异在毛细胞中活跃的增强子（图1C）。为了进一步探究Eh2和Eh3在毛细胞发育中的功能，研究在小鼠中分别敲除Eh2和Eh3，毛细胞发育完全正常或者仅有弱的发育异常。而同时敲除Eh2和Eh3，毛细胞数量明显减少；进一步发现，同时敲除三个Atoh1增强子使毛细胞数量进一步下降到最低点。正常的耳蜗毛细胞数量约个（图1D），敲除Atoh1的三个增强子后，毛细胞数量急剧减少到约86个（图1E），上述实验结果表明Atoh1的三个增强子协同调控毛细胞的形成。
图1.耳蜗毛细胞ATAC-seq，增强子验证和功能分析。A、耳蜗毛细胞流式分选和ATAC-seq示意图；B、Eh2和Eh3在毛细胞中保持开放，而在对照组中处于关闭状态；C、转基因小鼠耳蜗染色分析发现Eh3特异驱动毛细胞中EGFP报告基因的表达；D、正常野生型耳蜗毛细胞；E、同时敲除Atoh1的三个增强子引起毛细胞数量急剧减少。
研究人员利用CUTRUN技术，揭示了Atoh1蛋白在耳蜗毛细胞中的全基因组结合位点，发现Atoh1可以直接结合到Eh1、Eh2和Eh3这三个增强子上，从而调控Atoh1自身的表达（图2）。该结果提供Atoh1的三个增强子被敲除后，Atoh1表达水平显著下降，引起毛细胞数量急剧减少的分子机制。
图2.Atoh1和三个增强子的调控示意图。在正常毛细胞中，Atoh1蛋白可以直接结合到三个增强子（Eh1、Eh2和Eh3）上，促进Atoh1自身的表达。三个增强子被同时敲除，失去了自主调控作用，引起Atoh1表达下降，毛细胞数量减少。
该研究为在成年耳蜗支持细胞内如何重新启动Atoh1的表达提供了理论指导，有助于促进未来成年耳蜗毛细胞再生恢复研究。
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