原创生物世界生物世界收录于合集#新型基因编辑工具35个
撰文丨王聪
编辑丨王多鱼
排版丨水成文
年8月10日，中科院神经所杨辉研究员团队在NatureBiotechnology期刊发表论文，开发出了高保真Cas13突变体（hfCas13d），既能高效降解靶标RNA，又显著降低了旁系切割活性，为CRISPR-Cas13系统的安全应用打开了新的大门。
《生物世界》第一时间专访了杨辉研究员，通过此次专访，我们一起了解这一RNA编辑新工具，以及辉大基因的研究进展和杨辉研究员对基因编辑疗法的见解。
近年来，经过大规模的筛选，越来越多的CRISPR-Cas家族被相继发现，CRISPR基因编辑技术也因此迅速发展，工具种类逐渐增多，并广泛应用于基因编辑、基因治疗、农业育种、核酸定位及核酸检测等领域。
其中，VI型CRISPR-Cas13系统是新型CRISPR工具中耀眼的新星。与靶向DNA的Cas9蛋白不同，Cas13蛋白可以在crRNA的引导下降解靶标RNA。Cas13蛋白还有一种独特的活性——旁系切割（collateralcleavage），即在crRNA和靶标RNA同时存在的情况下随机切割体系中其他的单链RNA（ssRNA）。这种非特异性切割活性也被应用于核酸检测，例如张锋团队开发的SHERLOCK。
但是，如果将CRISPR-Cas13系统应用于动物或人类疾病治疗时，这种不受控的、随机切割ssRNA的活性就成了致命缺陷。因此，如何降低CRISPR-Cas13系统的旁系切割活性，成为了亟待解决的难题。
年8月11日，辉大基因、中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）杨辉团队在NatureBiotechnology上发表题为：High-fidelityCas13variantsfortargetedRNAdegradationwithminimalcollateraleffects的研究论文。
该研究通过一系列筛选获得了高保真Cas13突变体（hfCas13d），它们既表现出对靶标RNA的高效降解能力，又显著降低了旁系切割活性，为CRISPR-Cas13系统的安全应用打开了新的大门。
杨辉研究员表示，基因治疗管线都会面临三个通用的问题：递送、效率和脱靶。团队之前的工作发现了目前报道的最小的Cas13，即Cas13X，很好地解决了AAV病毒载体递送基因编辑工具的问题。而这项工作，很好地解决了Cas13系统的脱靶问题。下一个目标就是提高Cas13系统在大动物上的编辑效率，争取在更低剂量下达到治疗效果，为今后的临床试验拓宽治疗窗口。目前辉大已在多种疾病小动物模型上达到了很高的编辑效率和治疗效果，包括基因敲降（Cas13X/Y系统，90%）和单碱基编辑（miniCas13X-ADAR系统，80%），希望在不久的将来就能开展临床试验，力争做到全球第一个将Cas13系统应用到疾病治疗的企业。
杨辉本科毕业于上海交通大学生命科学学院，之后在中科院生化细胞所的李劲松实验室读博。年，杨辉获得吴瑞奖学金（华人生命科学领域在读博士的最高奖），前往麻省理工学院Whitehead研究所RudolfJaenisch实验室从事博士后研究工作。
博士后期间，杨辉与同实验室的王皓毅（现为中科院动物所研究员）一起成功构建了世界上第一只CRISPR-Cas9基因编辑小鼠，并发表了两篇Cell论文。年，杨辉回国并加入中科院神经所任研究员，当时28岁的他也成为中科院神经所最年轻的研究员。
年，杨辉创立了基因编辑疗法公司辉大基因，致力于人类罕见遗传疾病新型治疗技术及药物研发，目前辉大基因已完成数亿元C轮融资，同时在推进包括眼科、中枢神经系统和耳科在内的多领域研发管线。
杨辉研究员表示，Cas13是一种极具潜力的RNA编辑系统，相对于DNA编辑工具，基于Cas13的靶向RNA的基因编辑系统更安全，具有可逆性。此外，它对lncRNA的敲降（比如天使综合症的ATS-UBE3A）、对剂量敏感性基因（比如MECP2基因，多了少了都不好）的调控、对于单碱基的修复（没有PAM的限制，单个AAV可包装）都具有独特优势。相对于其他RNA编辑工具（比如Cas7-11s、Csm、内源ADAR、MS2-MCP等），Cas13系统在递送、效率、脱靶、适用范围等方面都具有一定优势。
杨辉研究员直言，Cas9以及Cas9依赖的基因编辑工具，专利保护得很好，其他企业已经没有机会了。而Cas13相对发现较晚，专利覆盖范围没有那么广。而且，之前发现的Cas13家族（Cas13a、b、c、d）蛋白都很大，有很大的改进空间。此外，RNA编辑工具相对于DNA编辑工具来说，具有可逆性，更加可控和安全。相比其他在RNA层面的调控技术（RNAi、ASO）来说，Cas13系统介导的RNA编辑工具更加特异和精准，还可以进行单碱基修复，具有更加广泛的应用空间。
杨辉实验室近年来深耕Cas13系统，并取得了一系列突破，今年1月份，团队自主开发的Cas13X和Cas13Y获得美国专利局授权。
在这项最新研究中，杨辉团队希望解决Cas13迈向临床应用的一大障碍——旁系切割（collateralcleavage），即在crRNA和靶标RNA同时存在的情况下随机切割体系中其他的单链RNA（ssRNA），这为CRISPR-Cas13的临床应用带来很大障碍。此前已有研究证明了旁系切割活性的产生机制：当Cas13蛋白在crRNA的引导下与靶标RNA结合后，两个HEPN结构域会发生不同的构象变化，并形成可以降解靶标RNA和其他非特异性RNA的催化位点。
然而，目前尚不清楚在活化的Cas13蛋白的催化位点附近是否存在靶标和非靶标RNA底物的不同结合位点。如果存在这样的位点，就可以通过Cas13蛋白的突变来选择性地去除与非靶标RNA的结合，从而消除旁系切割活性。
Cas13蛋白的结构示意图
基于此，杨辉团队构建了许多不同的Cas13蛋白突变体，包括常用的RfxCas13d（个氨基酸）及其团队之前发现的小尺寸、紧凑型Cas13X（个氨基酸），并设计了一个快速、灵敏的双荧光报告系统来检测Cas13突变体的旁系切割活性。
双荧光报告系统筛选hfCas13d突变体
研究团队发现，在多个工程化突变体中，一些Cas13突变体显著降低了旁系切割活性。例如，当使用Cas13d-N2V8和Cas13X-M17YY进行编辑时，转录组测序（RNA-seq）和细胞增殖分析表明旁系切割活性基本消失。
通过RNA-seq比较Cas13d和hfCas13d的旁系切割活性
进一步研究表明，在对转基因小鼠或腺相关病毒介导的体内细胞靶向中，这些Cas13突变体在显著降低了旁系切割活性的同时，仍能表现出与野生型Cas13相似的靶标RNA降解能力。此外，Cas13蛋白上的这些突变并不会增加转录组脱靶效应，也不会影响细胞的正常增殖。
转基因小鼠评估hfCas13d的靶标RNA降解能力和旁系切割活性
总的来说，这项研究通过突变筛选得到了两种hfCas13d突变体——Cas13d-N2V8和Cas13X-M17YY，它们具有显著降低的旁系切割活性，同时具有与野生型Cas13相似的靶标RNA降解能力。这些具有最小旁系切割活性的高保真Cas13突变体对于RNA编辑的基础研究和人类疾病治疗具有巨大的应用价值和发展潜力，为基于CRISPR-Cas13系统的安全的临床应用奠定了基础。
就在上个月，杨辉团队与复医院舒易来团队合作在ScienceTranslationalMedicine期刊发表论文，进行了首个基于RNA单碱基编辑治疗显性遗传性耳聋的临床前研究。详情：
除了在耳科领域的基础研究外，辉大基因还布局了耳科领域的临床管线，杨辉研究员告诉《生物世界》，自己和舒易来老师在波士顿就相识，回国后不久就开始了长久的、深入的合作。耳科领域相对于眼科领域来说，基础研究和临床要少很多，但是临床需求非常巨大，耳科病人是眼科的将近10倍。之前耳科领域基因治疗进展缓慢的原因就是递送工具不够特异，启动子也不够特异，而且耳蜗是一个非常精细的器官，非特异性的基因表达会对正常的听力功能造成不同程度的破坏。但是基因编辑、特别是RNA编辑很好地解决了这个问题。mRNA只在特异的毛细胞中表达，RNA编辑工具只能在毛细胞起作用，在其他细胞中，即便感染，也不会起作用。所以RNA编辑工具的安全性问题得到了很好的解决。这项发表在STM的工作，整体RNA编辑效率只有5%左右，但已经有显著的治疗效果。最近，经过辉大研发团队的不断改进，RNA编辑效率已经超过70%，在多种耳科疾病的效果已经达到了本领域最佳。辉大希望能和舒老师团队以及国内其他优秀的耳科团队继续合作，争取早日造福中国和全球的听力损伤的患者。
除了开发基因编辑工具外，辉大基因同时也在开发递送载体，杨辉研究员告诉《生物世界》，辉大在眼科和耳科方面已经开发出一些感染效率更高的AAV载体，这些保证了辉大在这两个领域的领先性。而在肌肉和神经系统方面，辉大正在非人灵长类中尝试筛选更高效的AAV载体，希望在未来的一年中，给大家带来好消息。此外，辉大还开发出了全新的VLP系统（virus-likeparticle，类病毒颗粒），在效率和安全性方面高于目前报道的所有VLP系统，希望很快就和大家见面。
在这篇论文中，杨辉研究员的署名单位还包括HuiEditTherapeutics（辉二生物，辉大生物子品牌），杨辉研究员表示，辉二主要聚焦于DNA编辑工具的开发，以及结合LNP递送技术，治疗以肝脏为靶器官的相关疾病，比如ATTR、HBV等等。在DNA编辑工具领域，虽然Cas9已经没有什么机会了，但是Cas12系统还是有一定的专利空间，比如以Cas12i为基础的Arbor公司（张锋等人创立），Cas14为基础的Mammoth公司（JenniferDoudna等人创立）。目前辉二已经开发出比Arbor公司更高效的Cas12Max（～个氨基酸），以及更小的Cas12mini（～个氨基酸），成功打破了国外CRISPRDNA编辑工具的垄断。未来希望Cas12Max和Cas12mini能更多地授权给国内外的细胞治疗企业以及农业公司，同时自己也会深耕LNP和AAV介导的体内基因治疗。
年6月，JenniferDoudna创立的Intellia公司在《新英格兰医学期刊》公布世界首个体内CRISPR基因编辑疗法的临床试验结果，这一进展引起巨大轰动，也证实了LNP递送CRISPR系统在体内进行基因编辑的可行性。杨辉研究员告诉《生物世界》，团队使用LNP递送CRISPR-Cas12Max在动物模型上的治疗效果比Intellia报道的还要好很多。但目前国内LNP和mRNA的GMP生产还需要一定时间成熟，希望早日能将这个管线推向临床，未来也会以此为基础，开发出更多有价值的临床管线。
辉大基因目前的研发管线分为眼科、神经系统、肌肉、耳科这四个领域，其中包括亨廷顿症、渐冻症在内的神经系统疾病。
辉大基因研发管线
许多BigPharma在亨廷顿症、渐冻症等神经系统疾病屡受挫折。杨辉研究员告诉《生物世界》，自己来自中科院神经所，接触的科研人员和医生大多是神经科学领域的，比较熟悉这一领域而且有这个情怀。此外，辉大一直的理念就是敢为天下先，神经领域挑战更多，机会也更多。BigPharma在神经领域折戟的原因大多还是因为在递送、效率或脱靶上面没有做到尽善尽美，而不是靶点的问题，特别是亨廷顿症的发病机理已经很清楚了。所以，辉大的目标就是全方位的在这三个方面不断的迭代、更新和突破，在各个神经管线领域，首先在动物水平的治疗效果，做到全球领先，之后再进一步开展临床试验，力争在某个神经疾病管线做到first-in-class。
论文链接：